作者：刘成; 汤剑明; 李洋; 杨将; 李倩男; 刘耀...转染慢病毒属nfe2l2成纤维细胞细胞外基质
摘要：目的利用慢病毒载体建立过表达Nfe2l2基因的L929细胞株，为探讨Nfe2l2基因在结缔组织成纤维细胞细胞外基质（ECM）重构中的作用奠定实验基础。方法2014年12月—2015年5月，通过双酶切将Nfe2l2目的基因连接到GV341载体（Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin），经扩增、转化、验证、测序、质粒抽提，将携带目的基因的工具GV341载体质粒及病毒包装辅助质粒Helper1.0、Helper2.0转染293T细胞，完成慢病毒包装及质量检测后获取慢病毒工具载体LV-Nfe2l2，病毒感染L929细胞72h后筛选稳定表达的细胞株L929/LV-Nfe2l2，采用RealtimeqPCR测定Nfe2l2的表达。结果经比对，构建的LV-Nfe2l2阳性克隆序列与目的基因Nfe2l2相符；L929细胞达到80%感染效率的最佳感染条件为：在ENi.S培养基中进行感染，设定感染复数（MOI）为8~10，感染时间为72h。Real-timeqPCR结果显示，经筛选的L929/LV-Nfe2l2细胞中Nfe2l2基因表达丰度为高（ΔCt值≤12）。结论本研究成功构建了一种过表达Nfe2l2基因的慢病毒载体；LV-Nfe2l2感染L929细胞后可实现目的基因的高表达，经筛选的L929/LV-Nfe2l2细胞株可用于后续实验研究。
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