作者：崔立文; 徐金升; 白亚玲; 张俊霞; 张胜雷肌细胞平滑肌细胞凋亡血管钙化酸碱环境半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3
摘要：目的探讨细胞外pH值的变化及其波动对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）凋亡的作用及机制。方法 2014年11月—2015年3月,选取8~10周龄健康雄性SD大鼠6只。采用简单随机抽样法选取2只大鼠,体外分离培养大鼠胸主动脉VSMCs。采用随机数字表法将VSMCs分为pH 7.4组和高磷组,高磷组又分为pH 6.8＋磷组、pH 7.4＋磷组、pH 7.7＋磷组和pH 6.8/7.7＋磷组。pH 7.4组采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养。高磷组采用高磷培养基（10 mmol/Lβ-甘油磷酸）培养,并根据数字酸度计的读取值酌情加入1 mol/L HCl或7.4%Na HCO3调整pH值;pH 6.8/7.7＋磷组第1天给予pH 7.7刺激、第2天给予pH 6.8刺激。将剩余4只大鼠按照上述方法培养,重复2次。采用免疫组织化学（SP法）进行细胞鉴定。采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）mRNA相对表达水平及B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）mRNA/Bcl-2相关X蛋白（Bax）mRNA。采流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果倒置相差显微镜下可见：大鼠胸主动脉组织块贴壁3~4 d后细胞从组织块边缘爬出,细胞为长梭形,呈束状排列;5~6 d成同心圆状细胞团,形成明显的细胞生长晕,并围绕组织块边缘呈束状、放射状延伸;6~7 d后细胞融合成片,细胞体梭形或不规则三角形,细胞质向外伸出2~3个长短不等的突起。免疫组织化学检测可见：细胞质表达强阳性。pH 6.8＋磷组Caspase-3 mRNA表达水平低于pH 7.4组,pH 7.4＋磷组、pH 7.7＋磷组Caspase-3 mRNA表达水平高于pH 7.4组（P〈0.05）;pH 7.4＋磷组、pH 7.7＋磷组、pH 6.8/7.7＋磷组Caspase-3 mRNA表达水平高于pH 6.8＋磷组（P〈0.05）;pH 7.7＋磷组Caspase-3 mRNA表达水平高于pH 7.4＋磷组,pH 6.8/7.7＋磷组Caspase-3 mRNA表达水平低于pH 7.4＋磷组、pH7.7＋磷组（P〈0.05）。pH 7.4＋磷组、pH 7.7＋磷组、pH 6.8/7.7＋磷组Bcl-2 mRNA/Bax mRNA分别小于
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