作者：李文学; 肖瑞刚; 吕苗苗; 丁宁; 石华荣; ...葡萄霜霉病菌cox2实时荧光定量pcr潜伏侵染定量检测
摘要：【目的】葡萄霜霉病是葡萄生产上重要的单年流行病害,研究旨在构建葡萄霜霉病菌(Plasmoparaviticola)的实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测体系,为葡萄霜霉病的早期诊断和预测预报提供依据。【方法】依据GenBank 中葡萄霜霉病菌cox2 基因序列设计1 对特异性引物(F-cox-Pv/R-Pv),建立并优化常规PCR 和real-time PCR 反应体系,利用葡萄霜霉病菌、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、葡萄白粉病菌(Uncinula necator)、葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)、葡萄溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)、白菜黑斑病菌(Alternaria br3assicae)、辣椒炭疽病菌(C. capsica)、甘草根腐病菌(Fusarium solani)、西葫芦白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)、番茄菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、马铃薯干腐病菌(F. equiseti)、西瓜枯萎病菌(F. oxysporum)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)等14 种葡萄及其他作物病原菌和拮抗菌的菌丝DNA 进行常规PCR 和real-time PCR 特异性检测,并对灵敏度和可重复性进行评价。运用已构建的real-time PCR 体系对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA 进行定量检测,利用SPSS 19.0 软件分析接种时间与叶片内葡萄霜霉病菌潜伏侵染量的关系。【结果】研究设计的引物特异性高,常规PCR 仅对葡萄霜霉病菌DNA 有扩增条带,为139 bp;real-time PCR 检测结果表明该对引物对葡萄霜霉病菌有唯一的产物吸收峰,对其他供试菌株均未检测到产物吸收峰。常规PCR 检测的灵敏度为10 pg·μL^-1,real-time PCR 的灵敏度可达到0.1 pg·μL^-1,是常规PCR 检测灵敏度的100 倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建real-time PCR 循环阈值(Ct)与模板浓度的线性关系,标准曲线y=42.27-3.36x,相关系数R^2=0.997,扩增效率为98.50%,线性范围达7个数量级,在2.4×10^3—2.4×10^9 copies/μL 呈现良好的线性关系。对人工接种葡萄�
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