作者：蒋红波; 冯英财; 刘世火; 王进军柑橘全爪螨超氧化物歧化酶生化特性重组蛋白药敏试验
摘要：【目的】笔者课题组前期研究发现,柑橘全爪螨在极端温度、杀螨剂、重金属和紫外线胁迫下,其体内Pc SOD3表达显著上调,暗示Pc SOD3在柑橘全爪螨应对不良环境胁迫的过程中起着至关重要的作用。为了进一步明确Pc SOD3的生理功能,本研究开展了该基因的异源表达及重组酶生化特性的分析工作。【方法】构建p ET28a-Pc SOD3重组表达质粒,并在大肠杆菌中实现异源表达。随后利用镍柱亲和层析法分离纯化Pc SOD3重组酶,采用Western blot对纯化蛋白进行验证。使用WST-1法分析Pc SOD3重组酶的抗氧化活性,测定不同反应体系pH及不同前处理温度下Pc SOD3重组酶的活性。采用氯化铬、叔丁基过氧化氢和过氧化氢异丙苯3种氧化性药剂,诱导大肠杆菌细胞内产生氧化应激反应,并利用Kirby-Bauer纸片琼脂糖扩散法测定上述3种药剂对过表达Pc SOD3大肠杆菌的抑制效果。【结果】在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中成功表达Pc SOD3,研究摸索出Pc SOD3重组蛋白最适诱导表达条件:诱导表达温度为18℃,摇床转速为160 r/min,当OD值达0.6时加入IPTG并使其终浓度为0.4mmol·L-1,诱导时间为18 h。Western blot验证结果表明所纯化重组蛋白即为Pc SOD3重组酶,重组蛋白大小为25.3k D。WST-1法测得Pc SOD3重组酶活性在p H=7.0的反应体系中最高,约为47.3 U/mg protein,而在前处理温度为25℃时,Pc SOD3重组酶活性最高为40.2 U/mg protein。利用K-B纸片琼脂糖扩散法进行了药敏试验,结果显示氯化铬对过量表达Pc SOD3大肠杆菌产生的抑菌圈均显著小于对空载体对照产生的抑菌圈,通过测量发现抑菌圈较对照缩小近20%;在150 mmol·L-1浓度下叔丁基过氧化氢对过量表达Pc SOD3大肠杆菌产生的抑菌圈与对照相比缩小约25%;而浓度为200 mmol·L-1的过氧化氢异丙苯对过量表达Pc SOD3大肠杆菌产生的抑菌圈与对照相比则缩小约15%。【结论】成功在大肠杆菌中实�
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