作者：洪晓武; 张亚平; 储以微; 高波; 邵先安; ...fkn基因重叠延伸拼接pcr基因克隆灵长类
摘要：目的克隆人、黑猩猩和叶猴FKN全基因及体外表达,比较研究FKN在进化过程中基因组水平和蛋白表达水平的差异。方法应用基因重叠延伸拼接PCR法（Gene splicing by overlapping extension PCR,SOE-PCR）将FKN的3个外显子编码序列依次进行前后拼接,然后插入pcDNA3.1/myc-His（-）A真核表达载体中,经酶切、测序鉴定后转染CHO细胞体外表达,RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物。结果酶切、测序鉴定证实插入的基因片段为完整的FKN,RT-PCR可从转染的CHO细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DN段,其表达蛋白能分泌至胞外,SDS-PAGE显示其分子量约为95000,抗c-myc抗体可与载体上的c-myc蛋白特异性结合。测序显示人、黑猩猩和叶猴相比,FKN基因除了有散在的点突变外,还发现有一明显的30bp的缺失,但此缺失对FKN蛋白的表达并不影响。结论成功克隆人、黑猩猩和叶猴FKN全基因,基因组水平和蛋白表达水平的比较研究为后续探讨FKN在高级灵长类物种进化过程中免疫学功能的演变奠定基础。
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