作者：贾宁; 戴辉; 毛海泉; 陈苏民; 易成刚; 郭...纳米微囊vegf成纤维细胞体外试验血管内皮细胞生长因子
摘要：探讨新型纳米微囊载体应用于基因治疗的可行性,安全性、转染效率、转移方法并与阳离子脂质体、质粒DNA进行比较.方法:以血管内皮细胞生长因子(VEGF165)为目的基因,构建真核表达载体pcDM3.1/myc-hi sA-VEGF165,分别利用纳米微囊、阳离子脂质体介导VEGF165转染鼠成纤维细胞(3Y1),转染4h后镜下观察细胞转染后表型变化,24、48h后通过绿色荧光蛋白的表达观察瞬时转染效率,通过免疫组织化学、Western Blot检测基因表达水平及定位.MTT法检测对转基因细胞的毒性.ELISA检测经G418筛选后上清培养液VEGF蛋白持续表达情况.结果:经G418筛选后的阳性细胞克隆,为高表达VEGF的鼠成纤维细胞模型.免疫组织化学证实pcDNA3.1/myc-hisA-VEGF165在转基因的细胞中呈高表达,定位于胞浆.Western Blot结果显示纳米微囊转染3Y1细胞48h后细胞胞浆及培养上清中均有VEGF蛋白表达.免疫荧光显示纳米微囊转染效率明显高于相应浓度的阳离子脂质体,转染4h后镜下观察细胞表型显示1 0mM浓度纳米微囊有较高的毒性.MTT测定示纳米微囊对3Y1细胞有显著的抑制增殖作用并随浓度梯度变化,ELISA检测发现纳米微囊、脂质体组培养上清中VEGF蛋白表达水平可维持4周,但纳米微囊组随时间变化而下降,瞬时表达水平高于脂质体组.结论:纳米微囊转基因载体作为一种新型非病毒载体,具备基因治疗应用潜能,可能为血管重建基因治疗提供了一种新的模式.
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