应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小窝蛋白1基因的神经细胞构建与功能鉴定

作者：权力; 江爱民; 卢彦宗; 朱耐伟; 朱勇喆基因编辑小窝蛋白神经细胞流行性乙型脑炎病毒

摘要：目的利用CRISPR/Cas9基因编辑系统建立小窝蛋白1（CAV-1）基因敲除的神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y）,并验证其对流行性乙型脑炎病毒（JEV）的易感性。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,基于人源CAV-1基因的外显子区（EXON）序列设计小向导RNA（sgRNA）,将sgRNA连接到载体PX459质粒上。将重组质粒转染至SHSY5Y细胞中,使用嘌呤霉素筛选稳定敲除CAV-1蛋白的SH-SY5Y细胞,并用免疫印迹法验证CAV-1蛋白的敲除效果。免疫荧光法比较CAV-1基因敲除的SH-SY5Y株与野生型细胞株对JEV感染性的差异。结果经酶切和测序鉴定,重组真核表达质粒构建正确,转染并筛选的单克隆细胞中没有CAV-1蛋白的表达,成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株。与野生型SH-SY5Y细胞株相比,CAV-1基因敲除的细胞株对JEV的感染性下降约90%（P〈0.001）。结论利用CRISPR/Cas9系统成功构建CAV-1基因敲除的SH-SY5Y细胞株,该细胞株可用于进一步研究CAV-1蛋白在JEV感染中的作用机制。

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