携带人S100A1基因的重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

作者：汪祥海; 魏强; 王晓彤; 查林涛; 杨玉雯腺相关病毒载体s100a1转基因治疗

摘要：目的：构建携带有人S100A1基因的重组腺相关病毒（Adeno-associated viru, AAV）载体，并对其进行鉴定。方法： 用BamHⅠ和EcoRⅠ将目的基因pUC57-Simple-S100A1和腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen1行双酶切，回收酶切质粒的目的片段进行连接，产物转化感受态DH5a，获得重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen-S100A1。酶切及测序鉴定后，将pAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper三质粒共转染AAV-293，包装重组腺相关病毒rAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1。收获重组病毒后感染HEK-293细胞，荧光计数法测定病毒滴度，病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功。结果： 重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1经双酶切和测序鉴定正确；荧光显微镜下观察转染AAV-293细胞 72 h后，病毒包装效率达95%~100%，荧光计数法测定病毒感染滴度达（2~3）×107 TU/mL；提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因S100A1片段。结论：成功构建携带有人S100A1的重组腺相关病毒载体rAAV-IRES-ZsGreen1-S100A1，收获的病毒具有较高滴度，为今后利用腺相关病毒载体进行S100A1基因转染治疗慢性心力衰竭的体外及体内研究提供了实验基础。

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