刚地弓形虫棒状体蛋白ROP16对小鼠脑神经细胞凋亡的影响

作者：高德俊; 常爽; 单秀梅; 范巍巍; 毛佐华刚地弓形虫rop16脑神经细胞凋亡

摘要：目的构建带有Flag标签的刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）棒状体蛋白16（ROP16）的重组慢病毒表达质粒,并检测ROP16蛋白在神经细胞中的表达及其对小鼠脑神经细胞凋亡的影响。方法PCR扩增带Flag标签的ROP16基因,克隆至慢病毒载体,构建重组质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag,转化至大肠埃希菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞,采用PCR、双酶切及测序验证。将重组质粒转染至人胚胎肾上皮细胞（293T细胞）中进行慢病毒包装,以p CDH-CMV-cop GFP空质粒对照组,荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况,并计算慢病毒滴度。将包装后的慢病毒感染人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）,采用蛋白质印迹（Western blotting）检测ROP16蛋白的表达情况。应用立体定位注射技术将慢病毒浓缩液注射至小鼠前额叶皮层M1区,2周后取小鼠脑组织,制备冰冻切片,TUNEL染色后,荧光显微镜下观察小鼠脑神经细胞凋亡情况。结果重组慢病毒表达质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag经PCR和双酶切后均获得大小为2 200 bp的条带,与预期值相符;测序结果与刚地弓形虫RH株ROP16基因（Gen Bank登录号为GQ249093.1）序列比对完全一致。包装后的慢病毒在荧光显微镜下可见绿色荧光,滴度约为2E＋8 TU/ml。Western blotting分析结果显示,在相对分子质量（Mr）120 000处有特异条带,重组慢病毒表达质粒能够在SH-SY5Y细胞内表达ROP16蛋白。感染慢病毒的小鼠脑组织冰冻切片经TUNEL染色后,荧光显微镜下可见实验组凋亡的细胞明显多于空质粒对照组。结论构建的慢病毒表达质粒p CDH-cop GFP-ROP16-Flag可在神经细胞内表达ROP16蛋白,并可导致小鼠脑神经细胞凋亡。

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