作者：赵乐; 马利刚; 张金燕; 冯卫生; 匡海学; ...独行菜基因克隆序列分析原核表达
摘要：目的为了研究独行菜黄酮类化合物生物合成途径的关键基因,从独行菜中克隆了黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase,F3H)基因,命名为LaF3H,并进行序列分析、原核表达和纯化。方法根据独行菜转录组数据中LaF3H基因序列设计特异性引物,克隆LaF3H基因的cDNA序列,构建pET-32a-LaF3H原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达LaF3H重组蛋白。结果 LaF3H基因开放阅读框(ORF)长1080bp,编码359个氨基酸,其蛋白质相对分子质量为40 320。序列分析结果表明LaF3H具有F3H蛋白的5个保守基序,系统进化分析结果显示LaF3H蛋白与拟南芥等十字花科植物F3H蛋白同源性较高。通过构建原核表达载体pET-32a-LaF3H,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达LaF3H重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱得到了纯化的LaF3H重组蛋白。结论克隆了LaF3H基因,获得LaF3H纯化蛋白,为下一步制备LaF3H蛋白抗体、酶学活性检测,研究LaF3H基因在独行菜黄酮类化合物生物合成途径中的功能奠定基础。
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