作者：王燕 杨学勇 刘晓林 张晓孟 余宏军 蒋卫...黄瓜果实动蛋白肽段原核表达
摘要：以黄瓜果实总RNA为模板,通过RT-PCR获得了动蛋白基因CsKF1和CsKF2的cDNA序列,进行测序,构建T-easy载体。SMART在线预测CsKF1和CsKF2均含有动蛋白(Kinesin)约340个氨基酸残基的马达区保守序列(moter domain)。体外表达蛋白的马达区和非马达区,将带有His标签的CsKF1-N、CsKF2-C、CsKF1-M、CsKF2-M融合蛋白通过E.coli BL21(DE3)表达,摸索不同诱导条件下目的蛋白的表达和纯化。其中His-CsKF1-N、His-CsKF2-C、His-CsKF1-M原核表达蛋白的分子量分别为25、30和40 kD,均以0.1 mmol·L-1 IPTG,22℃6 h诱导表达效果最好。His-CsKF2-M原核表达蛋白的分子量约38 kD,以18℃8 h诱导表达效果最好。融合蛋白His-CsKF1-N和His-CsKF2-C经过亲和纯化后作为抗原,通过5轮免疫注射兔子后,取心脏血作为抗血清,通过AminoLink Plus kit试剂盒亲和纯化得到多克隆抗体anti-CsKF1-N和anti-CsKF2-C。经过Western blot分析表明多克隆抗体具有特异性,可与抗原特异结合。
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