作者：丛晓杰; 马晓骊; 陈虹; 黄秉仁; 陈等yaf2hela
摘要：目的利用CRISPR／Cas9技术建立YAF2（YYlassociatedfactor2）基因敲除的宫颈癌HeLa细胞株，用于YAF2基因在宫颈癌细胞中分子功能的研究。方法首先利用CRISPR／Cas9序列设计网站，设计两对靶向YAF2基因第2外显子不同位点的向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）。化学合成sgRNA寡核苷酸序列，分别克隆至质粒pX335中，测序确认插入片段正确的克隆。先用一对重组载体转染HeLa细胞，7天后，再用另一对转染HeLa细胞，第2对转染3天后，取培养细胞的2／3提取基因组DNA，对敲除位点附近的片段进行PCR扩增后通过DNA测序对敲除效率进行分析，剩余细胞在96孔平板上通过有限稀释法筛选YAF2敲除的细胞株。用蛋白质免疫印迹实验初步鉴定YAF2蛋白质表达缺失的细胞克隆，提取其基因组DNA，对敲除位点附近的序列进行PCR扩增，将扩增产物克隆至pGEM—Teasy载体，通过DNA测序确认YAF2基因纯合敲除的细胞株。结果成功构建两对针对人YAF2基因第二外显子的pX335-sgRNA质粒；PCR产物测序证明两对重组载体均有YAF2基因敲除活性；得到2株YAF2敲除的HeLa细胞株。结论利用CRISPR／Cas9技术在HeLa细胞中成功敲除YAF2基因，为在HeLa细胞中研究YAF2的分子功能奠定基础。
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