作者：杨湘越 张惠菊 徐秀云 兰小鹏 朱忠勇自身抗原u1rnp70k克隆表达巴斯德毕赤酵母斑点免疫金渗滤法
摘要：目的人自身抗原U1RNP 70K通常采用组织提取法或原核表达获得。文中用基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人U1RNP 70K自身抗原,并建立斑点免疫金渗滤检测法。方法 PCR扩增U1RNP 70K基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-U1RNP 70K。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western b lot）鉴定。用所表达的蛋白包被硝酸纤维素膜,建立检测U1RNP抗体的斑点免疫金渗滤法（dot immuogold filtrationassay,D IGFA）。结果 PCR产物约为1300 bp,接近于预期的1314 bp,pPIC9k-U1RNP 70K重组阳性克隆测序结果与Gen-Bank中的U1RNP 70K序列完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物U1RNP 70K的相对分子质量约70 000。W estern b lot证实表达产物具有天然U1RNP 70K分子的免疫原性,阴性对照菌无目的条带表达。D IGFA的检测结果与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为94.74%（54/57）,阴性符合率为98.00%（49/50）,总符合率为96.26%（103/107）。2种方法检测结果无统计学显著差异（P=0.617）。结论在毕赤酵母中成功地高分泌表达了U1RNP 70K蛋白,并建立了简便、快速、准确检测U1RNP抗体的DIGFA方法。
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