作者：刘泽隆; 缪静; 屈慧鸽; 迟晓艳; 朱甫祥二硫键突变转基因分泌
摘要：凝血VⅢ因子(coagulation factor VⅢ, FVⅢ)分子内含有8对二硫键,参与维持其结构和功能,轻链A3结构域中Cys1899/Cys1903间的二硫键阻碍分泌,本室曾通过在FVⅢ重链和轻链间引入重组二硫键,证明其可促进消除B结构域的FVⅢ (B domain-deleted FVⅢ, BDD-FVⅢ)重、轻链异源二聚体的组装和分泌。本文在此基础上将BDD-FVⅢ的重链A2区Met662和轻链A3区Asp1828突变为Cys,从而构建可形成链间二硫键的变构体F8C。将F8C轻链A3区Cys1899和Cys1903突变为Gly,从而消除内源性二硫键,得到变构体F8CG,并探索这两种BDD-FVⅢ变构体的分泌促进作用。通过HEK293和COS-7细胞的基因瞬时转染实验,检测细胞表达变构体多肽的二硫键形成情况和培养上清中变构体多肽的分泌量和凝血活性,并检测变构体的血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)结合力。结果显示,细胞转基因表达产物F8C和F8CG均以二硫键连接的异源二聚体多肽为主,而野生型BDD-FVⅢ以易于解离的异源二聚体多肽为主。F8C分泌量和活性明显高于野生型BDD-FVⅢ, F8CG的分泌量和活性相对于F8C得到进一步提高,显示轻链二硫键的破坏对分泌具有促进作用,而对vWF的结合力无显著性影响。本文为进一步的变构体体内转基因研究奠定了基础。
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