作者：柳军凯; 贺鹏飞; 赖燕华; 刘欢; 宁婷婷; ...肽图l1抗原疫苗特征峰鉴别
摘要：目的:比较分析不同氨基酸序列人乳头瘤病毒(HPV)18型L1抗原的肽图,收集差异特征峰肽段,利用质谱方法对其进行鉴别。方法:将HPV18型L1抗原用胰蛋白酶水解,酶解所得的肽段通过RP-HPLC法分离肽段,得到HPV18型L1抗原肽图;用Megalign软件比较不同来源的L1抗原的氨基酸序列差异,分析不同HPV18型L1抗原的肽图特征峰,收集差异特征峰;HPLC色谱条件:采用C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以0.1%三氟乙酸-水为流动相A,0.1%三氟乙酸-乙腈为流动相B,梯度洗脱(0~10 min,100%A;10~80 min,100%A→30%A;80~91 min,30%A→100%A),流速1.0mL·min-1,柱温30℃,检测波长214 nm,进样量100μL。再运用UPLC-MS/MS技术,采用电喷雾离子源(ESI),正离子全扫描检测模式,喷雾电压2 kV,毛细管温度300℃,对差异特征峰进行鉴别。结果:5个公司生产的L1抗原平行6次重复检测,各共有峰保留时间的RSD最大值范围为0.24%~0.49%,表明肽图分析方法重复性良好。对5个公司的3批次抗原进行检测,主要峰保留时间的最大RSD范围为0.20%~0.74%,表明批间一致性良好。比较发现5个不同公司生产的HPV疫苗18型L1抗原的液相肽图有6个差异特征峰(1~6号),分别对其进行质谱鉴定,结合氨基酸序列的比对分析,发现5个特征峰由氨基酸差异引起:487~496位氨基酸的缺失将导致1号特征峰的缺失;88位氨基酸N和T的相互转变导致2、3号特征峰相互转变;494位氨基酸S和A的相互转变导致1、4号特征峰相互转变;5号特征峰为4号特征峰胰蛋白酶酶切不完全出现的;6号峰为非特异峰。表明不同公司生产的HPV18型L1抗原具有各自的特征峰。结论:本研究建立的HPLC-MS/MS肽图特征峰分析方法,可应用于不同企业生产的18型的HPV L1抗原的鉴别和质量控制,进一步表明了肽图在疫苗原液质量控制中的重要意义。
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