作者：曹文萍 苑海刚 刘平 朱静 李雪 胡琦tgfbi重叠延伸pcr人角膜上皮细胞转染
摘要：目的构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体和体外转染体系,为研究野生型及A546D突变型TGFBI基因的功能提供实验基础。方法应用重叠延伸PCR法定点诱变,构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,以阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人角膜上皮（human corneal epithelium,HCE）细胞,Western Blot法检测转染后培养基中HCE细胞分泌的TGFBI蛋白的表达。结果重组质粒总长约7.5 kb,由HindⅢ、XbaⅠ双酶切鉴定产生5.4 kb和2.1 kb两条片段者为克隆正确质粒。测序鉴定证实了TGFBI基因编码区完整插入到载体pcDNA3.1的多克隆位点中,突变载体的第1685位碱基由C替换为A,使其编码的第546个氨基酸由Ala突变为Asp即A546D突变。野生型及A546D突变型载体转染入HCE细胞后,TGFBI蛋白有效表达。结论成功构建了A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,为TGFBI基因相关性角膜营养不良致病机制的研究奠定了基础。
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