作者：王鲜 王旭 欧树安slug基因干扰腺相关病毒视网膜母细胞瘤增殖血管生成
摘要：目的构建并制备携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体。方法首先构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒,以PCR鉴定正确的pDC316-EGFP-Slug-siRNA克隆为模板扩增EGFP-Slug-siRN段,EcoRI和SalI双酶切后回收PCR产物。酶切pSNAV2.0-LacZ-α载体质粒,并与上述产物进行连接。转化感受态大肠杆菌DH5α,得到重组质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,酶切和测序对其进行鉴定。建立载体细胞株BHK/Slug-siRNA,大规模制备rAAV2-EGFP-Slug-siRNA并对其纯化、鉴定和滴度测定。将体外培养的视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）细胞转染rAAV-EGFP-Slug-siRNA和pSNAV2.0-EGFP空载体。鸡胚绒毛尿囊膜实验检测血管生成,MTT比色法检测细胞存活率,建立鸡胚绒毛尿囊移植瘤。结果携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA序列的腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,经PCR、酶切和测序鉴定,质粒构建正确。将构建成功的载体质粒与重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc/UL2共转染包装细胞BHK-2,成功复制和包装出重组腺相关病毒rAAV2-EGFP-Slug-siRNA,经检测目的片段插入成功,滴度为90.21×109puf。Slug-siRNA有效抑制RB细胞内Slug表达后,肿瘤血管密度明显降低,血管生成被抑制,细胞存活率明显降低。实体瘤血管生成和生长受到抑制。结论成功制备出高滴度的携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体。干扰Slug可抑制肿瘤血管生成,抑制RB细胞的生长增殖。
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