作者：周云刚; 杨举伦; 王力; 赵稳兴p21ras原核表达亲合纯化免疫活性
摘要：目的：构建Ki—ras—PET—28a（＋）原核表达质粒，并表达、纯化得到Ki—P21ras蛋白。方法：人工合成Ki—ras基因cDNA的蛋白编码CDs区序列，并在其正义链5′加上BamHⅠ酶切位点，3′加上HindⅢ酶切位点，经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到具有粘性末端的Ki—ras cDNA，将PET-28α（＋）同样经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到与Ki—ras cDNA有相同粘性末端的线形片段，通过T4DNA连接酶将具有粘性末端的Ki—ras cDNA与酶切后的PET-28α（＋）定向连接，构建重组质粒Ki—ras—PET—28a（＋），经酶切和测序鉴定。将鉴定正确的Ki—ras—PET—28α（＋）转入感受态细菌BL21（DE3）中诱导表达，利用组氨酸“标签”（His-Tag）对P21ras进行亲和层析纯化。结果：测序分析证实，克隆人PET-28α（＋）的Ki—ras序列与Genbank登录号为“M54968”的Ki-ras cDNA序列一致，将重组质粒Ki—ras—PET—28α（＋）转化BL21（DE3），IPTG诱导目的蛋白表达。SDS—PAGE和蛋白纯化结果表明，Ki—ras—PET—28α（＋）在大肠杆菌中获得可溶性高表达，经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的ki—P21ras蛋白，Western-Blot分析证实其免疫活性。结论：成功构建了原核表达载体Ki—ras—PET—28α（＋），并经表达、纯化得到具有生物活性的P21ras蛋白，为研究P21ras在肿瘤发病中的作用和机制以及抗P21ras细胞内抗体的研究奠定了基础。
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