作者：高晓梦; 张金璧; 李齐发猪vegfamicrornas双荧光素酶报告载体
摘要：为了扩增并分析猪卵泡颗粒细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)基因3编码区(3′UTR)序列、构建VEGFA 3′UTR荧光素酶报告质粒以及利用双荧光素酶报告基因验证miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系,试验通过RT-PCR扩增VEGFA 3′UTR,并用生物信息学方法分析预测其保守性及潜在的互作miRNA,最后将扩增的VEGFA 3′UTR序列克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-361-5p mimics(试验组)或NC mimics(对照组)共同转染293细胞,通过双荧光素酶报告系统检测两组细胞的荧光素酶活性,从而鉴定miR-361-5p与VEGFA 3′UTR的靶向关系。结果表明:在猪卵泡颗粒细胞中成功扩增了VEGFA基因3′UTR序列,其在哺乳动物中保守性较高,有多个潜在miRNA结合位点;成功构建了VEGFA基因3′UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-361-5p可以直接作用于VEGFA基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。
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