作者：胡蒙亮; 徐杰; 任航江; 韩亭亭; 满永; 唐...原核表达硫氧还蛋白融合表达
摘要：目的:构建人Ⅰ型11β羟基类固醇脘氢酶(11β-HSD1)原核表达载体并表达目的蛋白,为代谢综合征的研究奠定基础。方法:从HepG2细胞系中提取细胞总RNA,经反转录合成cDNA第一链后再以其为模版,扩增11β-HSD1基因。pET32a原核表达载体和PCR扩增出的产物经过BamHI和XhoI双酶切后,在16℃过夜的条件下用T4DNA连接酶连接上述酶切产物,然后用该产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞,挑克隆后进行测序。将克隆成功的11β-HSD1重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),分别用不同浓度、不同时间的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖)诱导其表达,并优化诱导条件。表达的蛋白采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合考马斯亮蓝染色的方法观察目的基因的表达情况。结果:挑选的克隆经测序证实pET32a-11β-HSD1重组质粒构建成功,11β-HSD1基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白trxA基因融合,在IPTG浓度为10μM,诱导时间为5小时时,上清中有明显的分子量约为52kDa的重组蛋白产生,且目的蛋白分子量的大小与预期一致。结论:本实验成功构建了人pET32a-11β-HSD1蛋白原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功诱导了其融合表达,目的蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在于上清中,为进一步研究其结构、功能、制备抗体等奠定了基础。
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