作者：林煊; 陈鹤丹; 谢颖; 曾柱; 胡祖权; 贾义...体外转录蛋白表达
摘要：目的体外转录获得小鼠黏蛋白1(MUC1) mRNA并在NIH/3T3细胞中表达。方法通过反转录PCR从小鼠4T1细胞中扩增MUC1基因,然后插入真核表达载体pc DNA3. 1(+)中构建重组表达载体pc DNA3. 1(+)-MUC1。双酶切鉴定正确后,以该质粒为模板,下游引物中引入血凝素标签(HA TAG)序列,PCR扩增MUC1-HA TAG融合基因片段,然后克隆至表达载体pc DNA3. 1(+),重组载体经双酶切鉴定和DNA序列测定后作为模板,PCR扩增获得含T7启动子和MUC1-HA TAG融合基因片段的PCR产物作为体外转录模板,通过体外转录、加尾、纯化最终获得修饰的MUC1 mRNA。通过多种转染试剂将体外转录MUC1-HA TAG mRNA转入NIH/3T3细胞,Western blot法检测融合蛋白MUC1-HA TAG的表达。结果反转录PCR扩增的MUC1基因长度约为1900 bp,酶切鉴定和序列分析证实MUC1-HA TAG融合基因已成功插入pc DNA3. 1(+)质粒。插入序列与Gen Bank中小鼠的MUC1基因序列完全一致,HA TAG正确插入MUC1下游,读框正确。Western blot法分析证实体外转录修饰的MUC1-HA TAG mRNA能在NIH/3T3细胞中表达。结论体外转录修饰的小鼠MUC1-HA TAG mRNA能在哺乳动物NIH/3T3细胞中翻译表达。
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