作者：李青; 吴雄文; 熊敏; 翁秀芳; 卢小玲; 梁...bira酶生物素化
摘要：目的: 构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21 (DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶.方法:用PCR法扩增BirA酶基因.将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA.经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化.以带有生物素酶底物肽(BirA substratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Western blot鉴定表达产物的生物素化活性. 结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61 300 的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白. ELISA和Western blot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化. 结论: 成功地制备了具有生物学活性的BirA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂.
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