作者：张胜权; 陈兵; 罗欣; 徐从贞克隆包涵体重折叠t细胞增殖
摘要：目的:克隆人细胞因子IL-21全长cDNA及其在大肠杆菌中表达,并进一步检测其表达产物的功能.方法:抽取外周血,分离淋巴细胞;抗CD3抗体刺激后,提取总RNA,通过RT-PCR获得两个部分重叠的IL-21 cDN段(分别为5′端242 bp,3′端425 bp),重组PCR扩增出IL-21全长cDNA.DNA测序正确后,将成熟IL-21 cDNA的编码框序列构建到原核表达载体pET28a(+)中.卡那霉素平板筛选及PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆菌进行IPTG诱导表达.SDS-PAGE、Western blotting鉴定,亲和层析分离纯化得到Mr为18 600的带有组氨酸标签重组人IL-21融合蛋白.透析法重折叠复性,MTY法测定其对T细胞增殖活性.结果:成功获得人IL-21全长cDNA,并以包涵体形式表达于大肠杆菌中.重折叠后的rhIL-21融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用.结论:获得具有生物学活性的rhIL-21细胞因子,为进一步研究其功能奠定基础.
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