作者：周广东; 王晓云; 刘德莉; 崔磊; 刘伟; 曹...重组逆转录病毒载体绿色荧光蛋白骨髓基质细胞软骨形成
摘要：目的：实现绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)报告基因在骨髓基质细胞(BMSC)中的高效、稳定、持久表达，直接示踪BMSC在关节软骨缺损内的分布及分化。方法：构建重组逆转录病毒表达载体RV-GFP，通过m7包装细胞克隆、G418筛选及扩增，获得大量含GFP基因的假病毒液，并直接转染BMSC。将含有GFP基因转染标记的BMSC与生物可降解材料复合后，植入猪自体关节软骨缺损处，7个月后共聚焦显微镜检测修复组织中GFP标记的BMSC的分布及分化。结果：经双酶切鉴定证实重组逆转录病毒表达载体RV-GFP构建成功，转染PT67细胞后可在荧光激发波长下，发出明亮的绿色荧光，转染率达20％-50％，经G418筛选后可达100％。筛选、扩增后，PF67细胞的上清培养液可成功地转染BMSC，筛选后能稳定、持久、高效表达GFP。将标记的BMSC植入关节软骨缺损7个月后，修复组织仍能高效表达GFP，激光共聚焦显微镜下显示，多数新生软骨陷窝内有GFP标记的细胞。结论：构建的重组逆转录病毒GFP载体，能持久标记骨髓基质细胞，用于细胞动态变化的研究及细胞转归的示踪，该方法简便、灵敏、可靠、直观。标记的BMSC可在关节软骨缺损内分化为成熟的软骨细胞，并在软骨缺损的修复中发挥重要作用。
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