作者：高芝; 张梁; 李由然; 顾正华; 丁重阳; 石...candidaamazonensis诱导型启动子基因敲除
摘要：【目的】构建一个适用于Candida amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并通过敲除C.amazonensis的丙酮酸脱羧酶基因（Pyruvate decarboxylase,PDC）对该系统进行初步验证。【方法】以gfpm（绿色荧光蛋白基因）为报告基因,通过添加相应诱导剂评估Spathaspora passalidarum来源启动子（SpXYLp、SpMAL6p、SpMAL1p、SpGAL1p）和Saccharomyces cerevisiae来源Sc GAL1p启动子在C.amazonensis中的诱导调控性能。选择严格诱导型启动子调控FLP重组酶的表达,并在FLP表达盒和潮霉素（Hygromycin B）抗性标记基因（hphm）两端添加同向重复的FRT位点,以PDC基因作为靶基因构建敲除盒PRFg HRP,转化宿主菌C.amazonensis CBS 12363,筛选得到阳性转化子后,通过添加诱导剂,表达FLP重组酶,实现FRT位点间片段切除。【结果】诱导调控实验表明启动子SpGAL1p（受半乳糖诱导）和SpMAL1p（受麦芽糖诱导）是适用于C.amazonensis的严格诱导型启动子。以SpGAL1p调控FLP基因表达,构建的敲除盒PRFg HRP成功转化宿主菌,获得阳性转化子C.amazonensis PDC01,通过添加半乳糖诱导,成功切除基因组中FLP表达盒和抗性标记盒,获得突变株C.amazonensis PDC02。【结论】首次建立了一个适用于C.amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并利用该系统成功敲除了C.amazonensis内的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造C.amazonensis酵母奠定了良好基础。
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