作者：王春花; 成军; 吴煜; 杨艳杰; 张黎颖; 党...抑制性消减杂交技术乙型肝炎病毒dna聚合酶末端蛋白反式激活基因分子生物学
摘要：目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶末端蛋白(TP)反式激活基因的差异表达的cDNA消减文库,克隆TP反式激活相关基因.方法以TP表达质粒pcDNA3.1(-)-TP转染HepG2细胞,以空载休pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到35个阳性克隆,经菌落聚合酶链反应(PCR)分析,得到34个200～1 000bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,显示14种已知基因编码蛋白和1种未加功能基因序列,可能是TP反式激活靶基因.结论成功构建乙型肝炎病毒TP反式激活基因差异发达的cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.
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