CRISPR/Cas9构建TGFBI稳定敲除HSC-3细胞系

作者：汪丙杰; 郑赛巍; 马聪聪; 史聪; 李玉婷; ...tgfbi基因敲除

摘要：目的利用CRISPR/Cas9技术稳定敲除人口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）细胞系HSC-3中的TGFBI基因。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对于TGFBI外显子3上下游的小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,并以PX330质粒为骨架构建能表达此sgRNA的真核重组质粒。将此质粒以及PGK-puro质粒共转染HSC-3细胞,用嘌呤霉素抗性筛选细胞克隆,并用PCR、核酸电泳和测序初步确定基因敲除情况,再通过实时荧光定量PCR及免疫印迹法确认细胞中TGFBI的mRNA和蛋白水平的表达变化情况。结果通过CRISPR/Cas9技术,HSC-3中的TGFBI基因外显子3的核苷酸序列已被完全敲除。免疫印迹法检测显示,相对于HSC-3,TGFBI敲除细胞中无法检测到TGFBI蛋白的表达。同时,通过RT-q PCR对部分基因进行检测,发现一系列与细胞周期和上皮间充质转化相关基因表达发生了改变（P〈0.05）。结论通过CRISPR/Cas9技术成功获得了TGFBI基因敲除的HSC-3细胞系,为进一步研究TGFBI在OSCC中的作用及其机制提供了理论基础。

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