作者：濮海平; 刘华; 刘相萍; 隋爱华; 杨堃; 吕...原核重组蛋白基因克隆化临床应用治疗总rna诱导表达pcr产物
摘要：目的克隆化人IL-10基因及重组蛋白的制备为IL-10基因表达在小儿炎症性、过敏性疾病中的作用及治疗等提供有力的证据.方法采用过敏症患者发作时期的外周血,提取总RNA.以总RNA为模板,特异性引物进行反转录,RT-PCR进行IL-10基因筛选.PCR产物经酶切分析和DNA序列测定后,构建重组质粒pTrchHis2B-hIL10原核高效表达载体,通过大肠杆菌(工程菌)JM109经IPTG诱导表达重组hIL-10蛋白,并经与Ni-NTA树脂中的6×His配体结合进行亲和层析纯化,表达产物进行SDSPAGE电泳分析.结果 DNA测序显示克隆化人IL-10全长开放读框准确,表达读码框正确.SDS-PAGE 分析显示,原核表达系统表达的重组蛋白量和纯度满意.结论采用以总RNA为模板的RT-PCR一步法,能简便、可靠地获得hIL-10基因产物,所构建的原核表达载体pTrcHis2B-hIL10,能够快速、高效制备rhIL-10蛋白,为细胞因子hIL-10功能的进一步研究及临床应用奠定了基础.
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