作者：何才姑; 郑文岭; 朴英杰; 胡莲美重组真核表达载体自噬人外周血单个核细胞增强绿色荧光蛋白大肠杆菌puc18pcr产物总rnacdna目的基因引物扩增酶切鉴定重组载体报告基因亚克隆测序克隆人步研究两步法逆转录特异性菌落
摘要：目的:探讨克隆人自噬基因hAPG12,构建重组真核表达载体pEGFP-C2-hAPG12,为进一步研究hAPG12的功能奠定基础.方法:从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,采用两步法RT-PCR,首先把RNA逆转录为cDNA,而后通过一对hAPG12的特异性引物扩增出目的基因,PCR产物与测序载体pUC18连接后转化到大肠杆菌DH5α,而后对单菌落进行菌落PCR、酶切和测序鉴定.将测序正确的hAPG12亚克隆入真核表达载体pEGFP-C2,该重组载体转化到大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR和酶切鉴定.结果:测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的hAPG12cDNAs含有225个碱基,与Genbank(BC011033)序列完全一致.构建的重组真核表达载体经鉴定证实hAPG12基因已完全正确亚克隆到pEGFP-C2.结论:成功克隆了人自噬基因hAPG12并构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组真核表达载体pEGFP-C2-hAPG12,为以后研究hAPG12的功能奠定基础.
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