作者：王艳慧; 陶妍三疣梭子蟹ptcrustin2成熟肽密码子优化毕赤酵母重组dna表达
摘要：Crustin是一系列富含半胱氨酸的甲壳动物来源的抗菌肽,是甲壳动物非特异性免疫机制中的重要免疫因子,其生物学功能由C端的成熟肽区域决定。参考三疣梭子蟹( Portunus trituberculatus ) PtCrustin2成熟肽的cDNA序列,根据毕赤酵母( Pichia pastoris )的密码子偏爱性对其相关密码子进行优化,合成5′端含 Xho Ⅰ限制性位点和Kex2信号肽酶切位点、3′端含 Xba Ⅰ限制性位点和6×his标签的目的基因“ smPtCrustin2 ”;以pPICZαA为表达载体,构建重组表达载体pPICZαA- smPtCrustin2,将其转入毕赤酵母X-33细胞后,通过含高浓度博来霉素的抗性平板筛选高拷贝甲醇利用快速型酵母转化子;筛选获得的酵母转化子在28 ℃、250 r/min条件下,使用0.5%甲醇诱导表达目的蛋白,并通过固化金属离子亲和层析(IMAC)对其进行分离纯化。Tricine-SDS-PAGE分析显示:纯化的重组体smPtCrustin2的分子量约为9.6 ku,并形成分子量约20 ku的二聚体。Western Blot分析进一步证明了纯化产物为预期的目的蛋白。建立的毕赤酵母表达系统获得了表达量为22.4 mg/L的重组体smPtCrustin2。
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