作者：张金丁; 金蕊; 杨丹丹; 王亚楠; 黄君健; ...tpp1基因shrna干扰western印迹免疫荧光
摘要：目的：构建抑制TPP1基因的短发夹RNA（shRNA）干扰载体。方法：以人的TPP1基因为靶序列，设计并合成shRNA序列TPP1-si1和TPP1-si2，分别与RNA干扰慢病毒载体pll3.7连接，双酶切鉴定质粒得到阳性克隆pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2，经测序正确后将其与慢病毒包装载体（RRE、REV、VSVG）共转染293T细胞，进行病毒的包装，将得到的病毒感染稳定高表达外源TPP1蛋白的HT1080细胞，通过Western印迹检测其对TPP1蛋白表达的抑制效果，并进行比较；将抑制效果好的病毒感染高表达外源Pot1蛋白的HepG2细胞，检测Pot1蛋白在内源TPP1被敲低的情况下能否在端粒定位。结果：经双酶切验证，外源片段成功插入载体pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2中；pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2均能明显抑制TPP1的表达，其中pll-TPP1-si1的抑制效果最好；pll-TPP1-si1病毒感染高表达外源Pot1蛋白的HepG2细胞，经免疫荧光鉴定能够有效抑制内源TPP1的表达，使Pot1不再端粒定位。结论：构建的抑制TPP1基因的shRNA干扰载体能有效抑制TPP1的表达，为端粒蛋白TPP1功能的研究奠定了实验基础。
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