作者：郝木强; 李彦英; 刘春杰; 王秀冬; 刘晶晶...水蛭素重组蛋白毕赤酵母中试放大
摘要：目的：通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进，建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白（EH）的中试发酵工艺，为EH蛋白的放大生产研究奠定基础。方法：首先通过摇瓶培养绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线，然后根据生长曲线，将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后，直接接种到500L的发酵罐中放大培养，通过发酵液的D_600nm值、溶氧值（D02）及菌体湿重动态监测细菌的生长状态，并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白；表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白；用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度；用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的相对分子质量；用Western印迹验证目的蛋白；用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。结果：发酵结束时，上清中蛋白含量达1．41g／L，经后期分离纯化，得到约21gEH蛋白，SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13．2×10^3±0．2×10^3，质谱分析相对分子质量约为7.3×10^3±0．73×10^3；Western印迹表明检测条带为目的蛋白，能被抗水蛭素抗体特异性结合；非还原型SDS-PAGE和HPLC测得EH蛋白的纯度均高于95％；凝块法检测EH蛋白的抗凝比活性为512～1024ATU／mg。结论：建立了一条简便可行的EH蛋白的中试放大发酵生产工艺。
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