作者：梁伟; 肖红; 高笑宇; 杜晓媛; 汪慧; 郭旭...kgf表达载体胚胎干细胞毛囊uhs红色荧光蛋白脂质体转染悬浮法
摘要：旨在构建小鼠角质细胞生长因子（KGF）真核表达载体pCDsR-UKA,通过脂质体转染法转染小鼠胚胎干细胞（mESC）,并进一步优化其转染条件,最终获得可以正常生长并稳定表达红色荧光蛋白的转KGF基因的ES细胞。利用RT-PCR技术扩增小鼠KGF基因cDNA并构建表达载体pCDsR-UKA（6.6 kb）,经鉴定正确的重组质粒DNA用脂质体包裹后转染mESC。从小鼠成纤维细胞cDNA扩增出891 bp的KGF基因片段与UHS启动子和BGH polyA序列成功重组到pCDsRed2载体中。经酶切和DNA测序验证,插入载体的DN段为KGF基因且方向正确。采用脂质体法优化转染条件,mESC最高转染效率达到（34.4±4.1）%。经G418筛选的转基因ES细胞通过PCR鉴定证实外源基因已整合在ES细胞基因组中。成功获得了小鼠KGF基因片段,以及真核表达载体pCDsR-UKA,经优化的脂质体悬浮法转染条件,在六孔板中当DNA与脂质体比例为3∶10时,可获得最佳转染效率且不改变ES细胞的生长状态,经筛选获得了转基因ES细胞克隆。为下一步通过四倍体补偿技术获得ES小鼠提供了转基因ES细胞。
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