神经元限制性沉默因子对人胰岛素基因转录调控作用的研究

作者：刘庆斌; 李艳华; 杨印祥; 袁红丰; 张锐; ...胰岛素启动子

摘要：为了研究神经元限制性沉默因子（NRSF）调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达，进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因．先用生物信息学手段对相关基因进行了分析．筛选及序列比对发现，人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相似的序列，提示，它可能受NRSF调控．构建了含NRSF基因的慢病毒载体，将其稳定转染于INS-1细胞．构建了3种荧光素酶报告载体：含有人胰岛素启动子-荧光素酶（hInsP-LUC）的慢病毒载体，pGL3-Basic载体和含有2拷贝NRSE样基序．荧光素酶（NRSE-LUC）的报告载体．利用稳定转染及瞬时转染实验观察NRSF对报告载体中荧光素酶活性的影响．利用电泳迁移率变动分析实验观察NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况，并通过竞争结合实验、引入特异性抗体实验证实探针与蛋白质结合的特异性．RT-PCR检测证实，感染空病毒的INS-1细胞不表达NRSF，感染含目的基因慢病毒的INS-1细胞能表达NRSF．将含有hInsP-LUC的慢病毒载体稳定转染于上述2种细胞，荧光素酶活性分析结果显示，NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性．瞬时转染hInsP-LUC报告系统于上述2种细胞，结果也显示NRSF能明显抑制胰岛素启动子-荧光素酶的活性．将含有NRSE-LUC的报告载体瞬时转染于上述2种细胞，结果表明过表达NRSF的INS-1细胞组的荧光素酶相对值比对照组有明显下降．电泳迁移率变动分析实验进一步证实，此NRSE样序列可以与NRSF蛋白特异结合，这种特异结合可以被标准的NRSE序列所竞争．结果表明，人胰岛素启动子中含有NRSE样序列，该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性．这一研究工作有助于进一步了解NRSF在胰岛细胞中的调控作用．

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