作者：刘如石; 邱义兰; 杨坤宇; 张智洪; 梁良; ...严重急性呼吸综合症核衣壳蛋白毕赤酵母真核表达
摘要：用PCR扩增SARS冠状病毒N蛋白全长cDNA,克隆到酵母表达载体pPIC3.5K,构建pPIC3.5K-SCoVN酵母表达质粒.表达质粒线性化后电转化到毕赤酵母GS115中,经G418-RDB,MM/MD平板与PCR扩增筛选获得His+Mut+重组菌株.比较研究了不同的培养基、溶解氧以及甲醇浓度对菌株生长与重组蛋白表达的影响.结果表明:FBS培养基最适宜重组菌的生长与表达,溶氧对菌体的生长与表达有显著的影响,甲醇诱导最佳终浓度为1%(V/V),SDS-PAGE分析重组蛋白的表达量,发现重组N蛋白表达量占细胞总蛋白的6%,每升培养基可以生产410mg重组N蛋白,生物量达45 OD600.Western blotting结果表明,重组N蛋白对鼠源单克隆抗体以及SARS病人恢复期血清具有较强的特异性反应.对摇瓶培养条件进行了发酵罐放大实验,结果生物量达到348 OD600,表达量达到2.5g/L,分别为摇瓶表达的7.7倍和6.1倍,为SARS早期血清学诊断研究以及为N蛋白在病毒复制以及致病机理的研究奠定了一定的基础.
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