作者：刘蔚; 成军; 张连峰; 纪冬; 刘妍; 郭江; ...抑制性消减杂交技术筛选rhalr调节基因大肠杆菌
摘要：目的：筛选与克隆重组人肝再生增强因子激活基因，了解其在体内的调节功能线索及机制．方法：应用大肠杆菌系统，表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白．刺激HepG2细胞，以溶剂：PH7．8的磷酸盐缓冲液为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经：Rsa Ⅰ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆．PCR扩增后进行测序及同源性分析．结果：成功构建重组人肝再生增强因子激活基因差异表达的cDNA消减文库．文库扩增后得到30个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200-1000 bp插入片段．对插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得19种编码基因，包括15种已知基因和4种未知基因．结论：筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因，推测了重组人肝再生增强因子在体内可能存在的调控机制的线索，尚需进一步的实验证明。
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