作者：齐晓勇; 党懿; 李树仁; 史力生; 孟存良; ...电生理特性体外诱导心肌特异性心肌样细胞心肌细胞密度梯度动作电位原位培养电流钳connexin
摘要：目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导培养后的电生理特性。方法以12只成年小型猪为研究对象,采用自身对照及组间对照研究。无菌条件下自双侧股骨抽取骨髓20 mL后,处死实验动物,提取正常心肌细胞。用密度梯度percoll法从骨髓中分离出单个核细胞,在培养液pH值为7．2、首次换液时间为48 h、种植密度为5×105／cm2条件下,原位培养并经传代2次后,体外用10μmol／L 5-氮胞苷(5-aza)诱导24 h,继续培养3周。采用免疫组化染色检测骨髓间充质干细胞心肌特异性间隙连接蛋白connexin 43(CX43)浓度的变化,应用电流钳观察MSCs体外诱导前及诱导后1、2、3周细胞内动作电位的产生情况,膜片钳全细胞记录模式观察MSCs体外诱导前及诱导后1、2、3周细胞膜瞬间外向钾电流(Ito)的变化并与正常心肌细胞比较。应用SPSS11．0软件包进行统计学处理,计量资料以均数±标准差表示,均数间比较应用t检验,P<0．05为差异有统计学意义。结果经10μmol／L5-aza诱导3周后,BMsCs细胞CX43蛋白阳性率为95％。膜片钳检测结果:未经5-aza诱导培养的BMSCs传代2次后,与正常心肌细胞Ⅱto电流密度在+80 mv时分别为(14．56±10．02)比(23．49±6．99)pA／pF,P=0．016。经5-aza诱导后培养1、2周,MSCs Ito电流密度分别为(16．43±8．84)和(18．76±9．06) pA／pF,与正常心肌细胞Ito电流密度相比差异有统计学意义(P<0．05)。诱导3周后的BMSCs Ito电流密度为(22．62±8．22)pA／pF,与正常心肌细胞Ito电流密度相比差异无统计学意义(P=0．225)。经5-aza诱导后培养1、2周的BMSCs未能检测到动作电位,诱导后3周的MSCs可检测到动作电位。结论经5-aza诱导后的BMSCs具有心肌细胞特有的结构蛋白CX43,可转化为具有动作电位和心肌Ito电流密度的类心肌样细胞。
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