禾谷镰刀菌14α-脱甲基酶的原核表达与纯化

作者：钱恒伟; 黄金光禾谷镰刀菌fgcyp51b原核表达蛋白纯化亲和层析离子交换分子筛

摘要：近年来,三唑类杀菌剂成为生产上防治小麦赤霉病（Fusarium Head Blight,FHB）的主要药剂,主要作用于甾醇生物合成中的14α-脱甲基酶（CYP51）,使真菌麦角甾醇的合成受阻,从而破坏细胞膜功能,起到杀菌的功能。本研究的目的是采用结构生物学的方法探究禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）中14α-脱甲基酶（FgCYP51B）的三维结构、生化功能以及其与三唑类杀菌剂的互作机制,进一步阐释禾谷镰刀菌对三唑类杀菌剂潜在的抗性风险。以禾谷镰刀菌（F.graminearum）的cDNA为模板,根据14α-脱甲基酶基因（FgCYP51B）序列设计特异性引物进行PCR扩增,克隆了FgCYP51B基因并构建了3个全长表达载体pHAT2-CYP51B、pETM-20-CYP51B和pETM-30-CYP51B以及3个蛋白截短体表达载体pHAT2-CYP51B50-527,pETM-20-CYP51B50-527和pETM-30-CYP51B50-527,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）,并利用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达。结果表明:全长FgCYP51B蛋白在BL21（DE3）和Rosetta（DE3）中均不表达;重组蛋白pHAT2-CYP51B50-527在大肠杆菌中不表达,而重组蛋白pETM-20-CYP51B50-527和pETM-30-CYP51B50-527成功表达,并通过亲和层析、离子交换与分子筛对重组蛋白进行纯化。该蛋白的表达与纯化为其结构功能的研究奠定了基础。

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