作者：徐华敏 姜宏 谢俊霞阳离子转运蛋白质类重组遗传腺病毒科
摘要：目的利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1（DMT1）编码基因的重组腺病毒。方法应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1-IRE的cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-DMT1-IRE,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组,利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆,经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1-DMT1-IRE。线性化的重组质粒转染HEK293细胞,获得高滴度的重组腺病毒。结果RT-PCR反应扩增出1841 bp的片段,重组质粒阳性克隆pAdEasy1-DMT1-IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性片段,PCR鉴定扩增出DMT1的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因DMT1-IRE。转染293细胞后细胞表达GFP荧光,显示293细胞稳定表达外源性的DMT1-IRE基因。结论携带DMT1-IRE基因的重组腺病毒质粒构建成功,获得高滴度的重组腺病毒,为DMT1基因进一步功能的研究提供基础。
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