作者：贾宾; 张维; 郭豫杰; 孔江南; 杨雪宸; 庞...大肠杆菌dncv重组表达uplc酶促反应
摘要：环二鸟苷酸(bis-(3’-5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate, c-di-GMP)是广泛存在于细菌中的第二信使分子,可通过STING (stimulator of interferon genes)信号通路参与先天免疫应答,是一种潜在的疫苗佐剂。为明确其先天免疫调节机制和评估免疫佐剂效果,c-di-GMP的高效合成急需解决。为建立一种相对简单、高效的c-di-GMP生物合成方法 ,实现体外制备c-di-GMP,本研究构建大肠杆菌(Escherichia coli)二核苷酸环化酶(dinucleotide cyclase V, DncV)重组表达载体,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达和His亲和纯化获得目的蛋白DncV;利用超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography, UPLC)检测DncV重组蛋白体外催化GTP生成c-di-GMP的反应。研究结果表明,IPTG诱导型表达载体pET-28a-His-DncV构建成功,亲和纯化获得的DncV重组蛋白纯度达到92%;该重组蛋白能够通过酶促反应一步生成c-di-GMP;金属离子对该酶活性影响显著,其中3种金属离子(Mg2+, Mn2+, Co2+)可提高催化效率,另外7种金属离子(Cu2+, Zn2+, Ni2+, Mo2+, Bo2+, Fe2+, Ca2+)抑制酶促反应。本研究建立了E. coli DncV重组蛋白催化合成c-di-GMP的方法体系,为c-di-GMP的大规模制备和功能研究提供了基础资料。
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