作者：郝英辰; 龙月; 郭豪; 李宁; 张松杰; 赵棋...烟草gcn2原核表达蛋白纯化多克隆抗体
摘要：GCN2 (general control non-derepressible-2)磷酸化真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor 2α, eIF2α)而抑制蛋白的翻译,从而感知氨基酸的缺乏并对各种胁迫做出响应。为了深入研究烟草(Nicotiana tabacum) NtGCN2的功能,本实验构建了烟草NtGCN2全长和N端NtGCN2(1~437 aa)的原核表达载体pET15b-NtGCN2和pCzn1-NtGCN2(1~437 aa),分别在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21-CodonPlus-(DE3)-RIPL、BL21-CodonPlus-(DE3)-RPL和BL21(DE3) Plys进行原核表达。Western blot结果显示,烟草NtGCN2全长和NtGCN2(1~437 aa)蛋白分别在大肠杆菌BL21-CodonPlus-(DE3)-RIPL和BL21(DE3) Plys中成功表达。其次,对NtGCN2全长蛋白的表达条件进行优化。结果显示,在16℃、0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)、13 h的诱导条件下,BL21-CodonPlus-(DE3)-RIPL的上清中获得了可溶的NtGCN2蛋白。采用阴离子交换柱Hitrap Q和Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析对蛋白进行初步纯化。采用包涵体复性的方法获得较纯的NtGCN2和NtGCN2(1~437 aa)蛋白。其中,NtGCN2(1~437 aa)通过Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后获得条带单一的纯蛋白。最后,利用获得的重组蛋白制备抗体,并对原核表达的NtGCN2全长和NtGCN2(1~437 aa)蛋白进行Western blot检测,结果表明制备的抗体均能有效识别NtGCN2蛋白。本研究实现了NtGCN2蛋白的原核表达和纯化,制备了NtGCN2的多克隆抗体,为进一步探讨植物GCN2的功能提供了基础资料。
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