作者：安凯; 孔惠萍; 邢小勇; 温峰琴; 包世俊vp60截段基因原核表达免疫原性免疫效力
摘要：兔（Lepus）出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV）属杯状病毒科（Caliciviridae）兔病毒属（Lagovirus）。VP60为RHDV的衣壳蛋白与免疫原性蛋白，且其抗原表位区主要集中在N端。本研究应用反转录（reverse transcription-PCR, RT-PCR）扩增获得VP60截段基因并将其亚克隆至pMD20-T，构建原核表达质粒pET-RHDV-VP60。转化大肠杆菌（Escherichia coli） Rosetta（DE3）后经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG）诱导表达，表达产物纯化后免疫Balb/C小鼠（Mus musculus）制备多抗，进而应用间接酶联免疫吸附试验（indirect enzyme linked immunosorbent assay, iELISA）和Western-blot对重组蛋白免疫原性进行分析。用混有弗氏佐剂的重组蛋白、商品苗、RHDV GS/YZ灭活苗、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline, PBS）分别注射易感兔，14 d后重组蛋白组加强免疫1次，21 d后用HA（hemagglutination）效价为210的RHDV GS/YZ肝脏悬液全部攻毒，观察14 d，并记录结果。结果表明：RHDV GS/YZ株VP60截段基因与RHDV HB株（登录号：KU207100.1）和RHDV WX株（登录号：AF402614.1）同源性最高，达98.6%；RHDV GS/YZ株VP60截段氨基酸序列与与RHDV WX株（登录号：AF402614.1）和RHDV Mexico 89株（登录号：AF295785.1）同源性最高，达99.1%；RHDV GS/YZ株VP60截段片段在Rosetta（DE3）中成功获得表达，且以包涵体形式存在；iELISA测定制备的多克隆抗体效价为1∶32 000；Western-blot结果显示，重组蛋白具有良好的免疫原性；免疫保护实验表明，免疫组在攻毒后全部存活，保护率为100%，商品苗血凝抑制效价为25~28，自制灭活苗为25~26，重组蛋白加佐剂为24~25，而只注射了PBS的对照组在攻毒后的96 h全部死亡，表明大肠杆菌表达的VP60截段蛋白在混有弗氏佐剂后能够完全抵抗RHDV强毒的攻击。研究结果为RHD亚单位疫苗的研发及其快速诊断方
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