作者：褚文辉; 张伟; 付晶; 李春义软骨内成骨鹿茸鹿茸干细胞
摘要：X型胶原蛋白（collagen type X, Col X）是影响软骨内成骨的关键因子之一。为研究Col X在鹿茸软骨内成骨中的作用，本研究采用RNA技术（RNA interface, RNAi）下调鹿茸干细胞中Col X的表达并研究离体情况下Col X下调后鹿茸软骨内成骨的变化。首先，本研究采集了生茸区骨膜组织（antlerogenic periosteum, AP）并进行原代培养，同时利用间充质干细胞表面标记物（Stro-1）对AP细胞进行定性分析。其次，针对东北梅花鹿（Cervus nippon） Col X mRNA，设计了4对特异性的shRNA（S1~S4），并通过酶切连接法将其构建至慢病毒载体pLVTHM中。利用293T细胞包装慢病毒、收集浓缩病毒后利用悬液法感染AP细胞，同时利用微粒培养对其进行成软骨诱导。成软骨诱导培养21 d后，利用qRT-PCR和Western blot技术验证Col X的表达变化，最后通过组织切片结合HE染色和阿辛蓝染色鉴定成软骨过程变化。结果表明，本研究成功构建了包含shRNA（S1~S4）的pLVTHM载体，慢病毒包装成功且病毒滴度达到1×108 TU/mL。qRT-PCR和Western blot结果表明，4组shRNA均能显著下调微粒体中Col X的表达（P＜0.05）。阿辛蓝染色发现，与阴性对照相比Col X下调后微粒体基质中阿辛蓝着色显著减少，说明基质中酸性粘多糖比例下降。同时，HE染色表明在粘多糖下降的同时伴随着部分软骨细胞的死亡表现为基质中无细胞陷窝空泡的增加。因此，综合判断Col X下调显著抑制或减缓微粒体成软骨过程，本研究为进一步研究Col X在哺乳动物软骨内成骨过程的作用提供理论依据。
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