作者：欧云文; 马炳; 马小元; 王俊; 丁耀忠; 张...美洲型orf7基因原核表达免疫原性
摘要：猪（Sus scrofa）繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是造成猪出现繁殖与呼吸障碍症状的主要病原之一，N蛋白作为该病毒主要的结构蛋白和抗原蛋白。为了研究美洲型猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（NA-PRRSV）N蛋白的免疫原性，本研究以NAPRRSV QH-08毒株的RNA为模板，扩增获得372bp的目的片段，扩增产物克隆入pET30a（＋）原核表达载体，构建pET30a-NA—PRRSV-ORF7重组质粒，转入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）；在37℃，以1mmol／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-d-thiogalactoside，IPTG）诱导表达6h；采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白，并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性：复性后重组N蛋白作为免疫原，经背部多点免疫新西兰大耳白兔（Oryctolagus cuniculus），采用Western blot检测兔血清抗体特异性。十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析表明，该ORF7编码基因在大肠杆菌中得到表达，蛋白大小约为24kD；Western blot检测结果表明，该重组N蛋白与NA-PRRSV阳性猪血清发生特异性反应，与猪细小病毒1型（Porcine parvovirus type 1，PPV1）和PCV2猪血清不发生交叉反应，制备的NA-PRRSV兔抗血清与重组N蛋白发生特异性反应。该实验成功构建了NA—PRRSV-ORF7原核表达载体，实现了ORF7基因在大肠杆菌中的表达，纯化后的复性蛋白具有较好的免疫原性，为NA-PRRSV检测方法建立或试剂盒的开发提供了理论依据。
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