作者：李西睿; 冯冲; 龙川; 纪慧丽; 魏静; 石宁...异种肝移植体细胞核移植基因敲除猪
摘要：猪（Sus scrofa）内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1（asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1）是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一。本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因（α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1）敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9）结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNA1（single guide RNA1,sg RNA1）,将sg RNA1与增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆。实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90%,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73%。选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达。对sg RNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象。总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料。
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