作者：李亚东; 汪康游; 樊帅; 杨兆勇; 田喜凤; ...海洋链霉菌caveranalyst
摘要：为获取全新来源并具有潜在高性能的海因酶，本研究通过对海洋沉积物进行以D-对羟基苯海因作为唯一氮源的选择培养基对潜在菌株进行初步筛选，然后通过双层琼脂法和微孔快速筛选法对初筛菌株进行复筛，并结合分子生物学筛选方法进行终筛，最终得到桔橙小单胞菌（Micromonosporaaurantiaca，GenBank登录号：FJ547135．1）、金色链霉菌（Streptomycesaureofaciens，GenBank登录号：AB326923．1）、桑氏链霉菌（Streptomyces sampsonii，GenBank登录号：GU238264．1）和链霉菌7．145（Streptomycessp．7—145，GenBank登录号：JQ782979．2）4株产D-海因酶的阳性链霉菌。用兼并引物扩增4株阳性菌中的D-海因酶表达序列，转化大肠杆菌（Escherichia coli），并构建表达相应D-海因酶的工程菌株E．coliS1、E．coliS14、E．coli$29和E．coliSl45，提纯4种D-海因酶，并测定酶的酶活和动力学参数。结果显示，链霉菌7．145菌株中表达的海因酶活性最高，比活力为9．7U／mg，催化速度常数Kcat=3．2×10-66／s，Kin=9．5mmol／L。最后利用Swiss—model软件对其进行在线同源模建和CaverAnalyst软件对链霉菌7—145菌株来源的海因酶的催化通道进行结构模拟分析。模拟分析结果显示，本研究中D-海因酶的主要催化通道Tunnel1长度为9．1A，瓶颈氨基酸残基为59位的组氨酸、181位的组氨酸和313位的谷氨酸，瓶颈半径为2．18A；潜在的催化通道Tunnel2长度为13．6A，瓶颈氨基酸为62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸，瓶颈半径为1．52A。如果对Tunnel2通道中的62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸进行定点突变，有望开发出一种性能更优的D-海因酶。本研究提供了一种全新的海因酶阳性菌筛选体系，通过计算机模拟手段能够更直观了解海因酶的催化机制，为进一步获得性能更优的海因酶奠定基础。
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