作者：孙亚丽; 张德辉; 赵亮; 夏聪聪; 丑敏霞天蓝苜蓿内参基因荧光定量pcrgenorm软件
摘要：豆科植物-根瘤菌共生体系因固氮能力卓越,肥土效应明显,常被作为先锋植物进行环境修复.利用qRT-PCR分析铜胁迫下天蓝苜蓿（Medicago lupulina L.）与根瘤菌（Sinorhizobium meliloti,CCNWSX0020）共生固氮过程中差异基因时,由于环境中铜离子差异可能使持家基因表达不稳定,因此需要筛选合适的持家基因作为内参.本研究选取8个天蓝苜蓿的持家基因（肌动蛋白（beta actin,ACT）、组蛋白（histone H2A,H2A）、核糖体蛋白18S （ribosomal 18S,18S）、微管蛋白（tubulin beta,TUB）、泛素连接酶（ubiquitin,UBI）、延伸因子1（elongation factor 1,EF1）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）和亲环蛋白（cyclophilin,CYP））作为候选内参基因,人工模拟不同水平铜（浓度分别为50、100、150和200 mg/kg）污染,以接种根瘤菌后30 d的天蓝苜蓿根为材料,筛选最佳内参基因.经引物特异性及PCR扩增效率检测,各候选内参基因引物均符合稳定性筛选要求.荧光定量PCR分析结果表明,8个候选内参基因的表达水平和稳定性随铜离子浓度不同而呈现差异.在线评估所有样品中候选内参基因表达稳定性,结合geNorm软件分析最佳内参基因组合数目,结果发现,最适内参基因组合为GAPDH和EF1;分别在线评估不同铜浓度处理下候选内参基因表达稳定性,结果表明,低浓度铜（≤50 mg/kg）处理下最佳内参基因为GAPDH,中高浓度铜（≥100 mg/kg）处理时最佳内参基因为UBI.本研究结果为铜胁迫下天蓝苜蓿共生结瘤过程中差异基因的表达分析提供了基础资料,同时为其他重金属胁迫下内参基因的筛选提供了参考和借鉴.
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