作者：杨松柏; 余璐纯; 刘向东; 李新云; 樊斌; ...载体构建嘌呤霉素
摘要：microRNA-124（miR-124）丰富表达于脑组织中，调控神经细胞分化，同时在肿瘤组织中，miR-124还参与调控肿瘤细胞的增殖。分析表明，猪miR-124的前体序列位于4号和14号染色体中。本研究从长白猪（Sus scrofa）DNA基因组中扩增miR-124的前体序列，连接到T载体中，再经过EcoR Ⅰ和NotⅠ双酶切T载体，回收相应的酶切片段，将酶切片段连接到PiggyBac（PB）转座子载体中，然后将重组载体（PB-miR-124a1, PB-miR-124a2）转染猪肾细胞系PK15细胞，通过绿色荧光蛋白的表达检测转染效率，用嘌呤霉素进行稳转细胞的筛选，最后通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定细胞内miR-124的表达活性。结果显示，成功构建了重组转座子载体PB-miR-124a1和PB-miR-124a2，观察绿色荧光蛋白的表达，显示转染效率较高；稳定筛选的最佳嘌呤霉素的浓度为2 μg/mL。qRT-PCR结果显示，和对照组相比，稳定转染PB-miR-124a2组miR-124的表达显著升高（P＜0.01），而转染PB-miR-124a1组miR-124的表达升高不显著（P=0.06），说明miR-124的本底表达主要来源于ssc-mir-124a2基因。本实验为研究猪miR-124功能机制提供了基础材料。
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