作者：韩勇娟; 曾水清; 胡义珍; 张海江基因表达载体培养的人视网膜色素上皮细胞表达定位细胞周期蛋白激酶抑制因子western绿色荧光蛋白荧光显微镜基因重组技术重组表达质粒blot细胞核内融合基因pcr扩增脂质体转染dna测序pegfpp21基因全长序列
摘要：目的构建绿色荧光蛋白GFP-p21融合基因表达载体,并观察其在人视网膜色素上皮细胞中的表达及定位,为研究细胞周期蛋白激酶抑制因子p21对视网膜色素上皮细胞细胞周期的影响提供实验基础.方法以含有p21的全长序列的质粒为模板PCR扩增p21cDNA,应用基因重组技术与GFP基因融合,构建以绿色荧光蛋白GFP为报告基因的重组表达质粒pGFP-p21.利用脂质体转染体外培养的人视网膜色素上皮细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pGFP-p21融合蛋白在细胞中的分布和定位,用WesternBlot方法分析其蛋白的表达.结果①酶切、DNA测序均证实插入片断的正确性.②荧光显微镜观察结果显示在空载体pEGFP-C1转染组中,细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒pGFP-p21转染组中,绿色荧光主要集中在细胞核内.③WesternBlot证实了pGFP-P21融合基因的表达.结论成功的构建了pGFP-p21质粒.视网膜色素上皮细胞能高效表达pGFP-p21融合基因,且主要定位于细胞核内,与p21基因的表达方式相同.
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