作者：张正; 刘丹平; 陈峻江; 郭韬; 张男骨形态发生蛋白2基因绿色荧光蛋白腺病毒载体同源重组成骨诱导
摘要：目的构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的骨形态发生蛋白2（BMP2）目的蛋白和报告分子绿色荧光蛋白（GFP）的新型腺病毒真核细胞表达载体。方法将去除翻译终止密码子并添加新的酶切识别住点XhoI的BMP2基因定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV—IRES—hrGFP-1。携带BMP2＊基因的重组腺病毒穿梭质粒经酶切鉴定、PmeI酶切线性化后转化BJ5183-AD-1大肠杆菌，利用细菌内同源重组机制将BMP2＋和GFP基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒。用PacI酶切去除其质粒成分，暴露腺病毒基因组的反向末端重复序列，转染293细胞，进行腺病毒的包装，完成新型腺病毒载体AdCMV—BMP2＋-IRES—GFP-1的构建。作为阳性对照，同时制备多年来广为应用的BMP2腺病毒表达载体AdCMV—BMP2。以两种载体感染骨髓基质细胞，通过RT—PCR和荧光显微镜分别检测骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白表达情况；通过碱性磷酸酶活性检测判断BMP2诱导成骨分化作用。结果突变后骨形态发生蛋白2基因序列、重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒质粒酶切图谱符合预定设计。感染骨髓基质细胞后，新型腺病毒载体可同时表达报告分子GFP和具有诱导成骨分化活性的BMP2。结论成功构建表达BMP2的新型腺病毒载体。
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